В горе и радости: ученые МФТИ смоделировали поведение лизосомы в обычных и стрессовых условиях

Ученые из Московского физико-технического института (МФТИ) с коллегами из России, Китая и Франции разработали интерактивную модель ионного и водного баланса лизосом — клеточных органелл, отвечающих за переработку питательных веществ и внутриклеточного «мусора», а также управляющих метаболизмом клетки. Модель впервые воспроизводит поведение лизосомы при стрессах: от кратковременного повышения проницаемости мембраны до накопления недеградирующего мусора. Она также позволяет заранее рассчитывать последствия экспериментальных вмешательств в ионный транспорт лизосомы. Интерактивная версия доступна на lysomodel.mipt.ru — ее можно запустить прямо в браузере и посмотреть, что будет с pH, концентрациями ионов, трансмембранным потенциалом лизосомы, если выключить протонную помпу или нарушить проницаемость мембраны.

Лизосомы— клеточные «перерабатывающие заводы». Они поддерживают кислую среду внутри себя (pH 4,5–5,0), необходимую для работы переваривающих ферментов, и служат хранилищем кальция. Нарушения в работе лизосомы связаны с нейродегенеративными заболеваниями, диабетом второго типа и рядом редких генетических патологий. До сих пор ни одна теоретическая модель не воспроизводила полностью наблюдаемые экспериментально параметры лизосом, а реакции лизосомы на биологические стрессы не рассматривались вовсе. В результате было сложно использовать модели для планирования и объяснения экспериментов. Понимание механизмов адаптации, то есть отклика на стресс, сопротивления организма и клетки болезни — это то, что позволяет разрабатывать лекарства. Поэтому стресс-ответ сейчас привлекает внимание ученых, фармацевтических компаний (статьей интересовалась Lysoway Therapeutics, США) и врачей.

Чтобы сделать адекватную модель, исследователи из МФТИ с коллегами выбрали путь от эксперимента к теории. Они опирались на собранные массивы данных пэтч-кламп лизосом.

В этом методе к мембране искусственно раздутой органеллы приставляют тонкую стеклянную пипетку с электродом внутри. Когда контакт достигнут, ученые могут напрямую измерить электрические токи, идущие через мембрану, от отдельных ионных каналов и транспортеров. Эти токи показывали, сколько ионов проходит через каждый белок при разных значениях pH и потенциала.

Николай Ильинский, к. ф.-м. н., старший научный сотрудник лаборатории старения и возрастных нейродегенеративных заболеваний Центра исследований молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний ЛФИ МФТИ, доцент кафедры биофизики ЛФИ МФТИ прокомментировал:

Мы встроили в модель белки с экспериментально определенными характеристиками на основе данных, полученных нашим соавтором, уважаемым ученым ЦаномЧуньлеем(ChunleiCang), профессором Научно-технического университета Китая (UniversityofScience andTechnologyofChina). Он проделал огромную работу, охарактеризовав около 10 разных лизосомныхтранспортеров методом пэтч‑кламплизосом, заложив фундамент для строительства нашей модели, за что мы ему искренне благодарны.

Модель построена на системе обыкновенных дифференциальных уравнений, которые описывают изменение концентраций ионов, объема лизосомы и мембранного потенциала во времени. В основу легли уравнения и константы, использованные в более ранних работах других исследователей, но набор белков был существенно обновлен.

Мы начали строить теоретические предсказания, чтобы объяснить неожиданные результаты своих экспериментов,— поясняет Николай Ильинский.— Лизосома находилась в живой клетке, которая испытывала “голод”. При принудительном подщелачивании оказывалось, что кислотность лизосомы нестабильна. Наш соавтор, Семен Валерьевич Нестеров предположил, что от голода в лизосоме снизилась буферная емкость, то есть способность противостоять изменению pH при добавлении кислот или щелочей. София Федоровна Назарова подтвердила эти предположения, заложив снижение буферной емкости в модель и получив те же “неспокойные” отклики, которые мы видели на клетках.

Исследователи начали с полного списка белков лизосом человека — 823 белка из базы Gene Ontology. Они построили сеть их взаимодействий и разделили на семь функциональных кластеров, отвечающих за эндоцитоз, аутофагию, регуляцию pH и транспорт веществ. Среди них особо выделили 99 белков, связанных с поддержанием кислотности: насосы, закачивающие протоны, каналы для кальция, натрия, калия и хлора, а также белки, отвечающие за выход протонов. В математическую модель включили только те из них, для которых уже были измерены реальные ионные токи методом пэтч-кламп, то есть точно известно, как белок пропускает ионы в зависимости от концентрации и мембранного потенциала. Такими «представителями» стали вакуолярная H+-АТФаза, хлоридный обменник ClC-7, кальциевый канал TRPML1, натриевый канал TPC1 и кальциево-протонный антипортер TMEM165. Благодаря этому в модели оказались почти все основные типы ионного транспорта, хотя многие другие белки пока ждут экспериментального описания своих свойств.

София Назарова, студентка магистратуры второго курса Физтех-школы физики и исследований им. Л. Д. Ландау:

По сути, основная работа заключалась в функциональном и математическом описании работы белков, обеспечивающих активный транспорт ионов. Конечно, невозможно учесть все факторы, влияющие на их работу, но мы постарались собрать максимум информации и объединить ее в строгую математическую модель. В предыдущих моделях оставались неразрешенными несколько принципиальных вопросов. Какой транспортер поддерживает высокую концентрацию натрия в лизосоме? А кальция? Уже на финальном этапе работы над публикацией мы обнаружили, что только что вышли две статьи, в которых наконец нашли белок, отвечающий за наполнение лизосомы кальцием — TMEM165. Мы включили параметры работы этого транспортера в модель, что уточнило ее и сделало по-настоящему современной. Это поможет расширить понимание работы лизосом и ускорить ее изучение.

Рисунок 1. Отбор белков ионных транспортеров для модели среди всех известных лизосомныхбелков человека. Звездочками отмечены вошедшие в итоговый вариант. Источник: Journal of General Physiology

Вакуолярная H+-АТФаза (vATPase) — главный «насос», который за счет энергии АТФ закачивает протоны внутрь лизосомы и создает кислую среду. Хлоридный обменник ClC-7 пропускает внутрь два иона хлора в обмен на один протон наружу, помогая компенсировать электрический заряд. Кальциевый канал TRPML1 выпускает кальций из лизосомы, а натриевый канал TPC1 обеспечивает выход натрия. Недавно охарактеризованный кальциево-протонный антипортер TMEM165, наоборот, втягивает кальций внутрь, используя энергию протонного градиента. Параметры модели (число молекул каждого транспортера и их проницаемость) подбирали так, чтобы рассчитанные токи максимально точно совпадали с реальными кривыми, полученными в пэтч-кламп экспериментах на изолированных лизосомах.

Рисунок 2. Схема ионных транспортеров и пассивных потоков, включенных в модель лизосомы. Показаны основные белки: протонный насос vATPase, хлоридный обменникClC-7, натриевый канал TPC1, кальциевый канал TRPML1 и кальциево-протонный антипортерTMEM165. Стрелками обозначены направления движения ионов. Концентрации ионов указаны снаружи (цитоплазма) и внутри (лизосома). Источник: Journal of General Physiology

«Мы постарались построить компьютерную модель поддержания гомеостаза лизосом, которая бы проверялась на адекватность не только стабильностью и соответствием выдаваемых параметров экспериментальным,— поясняет Николай Ильинский.— Наша модель проверялась стрессами: созреванием лизосомы, разрывом ее мембраны, разбуханием, подщелачиванием и накоплением мусора».

При имитации созревания поздней эндосомы в лизосому постепенное увеличение числа vATPase и снижение активности Na+/K+-АТФазы примерно за полтора часа приводило к падению pH с 5,8 до 4,6. Подобные значения получались ранее в экспериментах на выделенных лизосомах.

Целостность мембраны лизосом теряется при старении клеток, кроме того разрыв мембраны органелл в опухолевых клетках лекарствами является одним из рабочих подходов лечения. Поэтому важно было смоделировать такой стресс. Кратковременное повышение проницаемости мембраны лизосом ожидаемо вызывало подщелачивание, выход кальция и небольшое набухание.

Подщелачивание лизосомы при кратковременном отключении vATPase или усилении водного притока также давали обратимые сдвиги всех параметров, без катастрофических последствий.

Особенно важным оказался результат, связанный с кальцием. Как при ингибировании vATPase, так и при дополнительном оттоке протонов (который в лаборатории вызывали оптогенетическис помощью родопсинов) концентрация кальция в лизосоме снижалась почти вдвое! Модель показала, что причиной истощения кальция в лизосоме при подщелачивании может быть не только усиление выхода через кальциевый канал TRPML1 (мутации в гене которого вызывают редкое наследственное генетическое заболевание муколипидоз IV типа), но и, наоборот, ослабление входа через кальциево-протонный обменник TMEM165 при подщелачивании.

Наконец, модель также воспроизвела условия, при которых в лизосоме задерживаются слабоосновные катионные амфифильные препараты — «протонные губки». Их присутствие имитирует ситуацию, при которой внутри органеллы копится мусор, который она не может переработать. Этот стресс было важно рассмотреть, поскольку он является причиной лизосомных болезней накопления. Протонирование мусора внутри лизосомы повышало осмотическое давление, вызывало набухание и заметно подщелачивало органеллу. Эти результаты согласуются с экспериментальными наблюдениями и помогают понять механизм нарушения работы органеллы веществами, которые могут применяться как лекарства. Например, хлорохин, принимаемый пациентами длительно при аутоиммунных заболеваниях (например, ревматизме) как раз приводит к накоплению мусора в лизосомах клеток пигментного эпителия и развитию хлорохиновойретинопатии.

В итоге главное отличие новой модели — способность сохранять устойчивость при реалистичных стрессах и предсказывать последствия узконаправленных вмешательств, которые теперь можно проводить оптогенетически с помощью лизосомно-направленных родопсинов. Это открывает путь к более точным экспериментам и поиску способов укрепить лизосомную устойчивость при болезнях и старении. Следующий шаг, необходимый для улучшения модели, состоит в экспериментальном обнаружении и описании свойств лизосомного NHE-подобного белка, который отвечает за поддержание высокой концентрации натрия. Без него ни одна нынешняя модель не может полностью воспроизвести физиологический градиент натрия.

Исследование опубликовано в Journal of General Physiology. Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (гранты №24-24-00504 и №24-74-00059) и Министерства науки и высшего образования РФ (соглашение №075-03-2026-305, проект FSMG-2024-0012).

Изображение на обложке: разработано Magnific

Источник: Минобрнауки России